Hepburn était un missionnaire médical à Amoy et à Singapour de 1843 à 1845. En 1859, après l'ouverture du Japon aux Américains, lui et sa femme ont navigué sous la commission du Conseil presbytérien pour Kanagawa. Ils sont arrivés au Japon le 18 octobre 1859 et étaient parmi les premiers missionnaires américains au Japon.
Il a ouvert un dispensaire, où, en 1869, il s'occupait de 30 à 50 patients japonais par jour. Il a également animé une classe de formation pour de jeunes hommes japonais. Il était l'un des fondateurs et le premier président de Meiji Gakuin, une école pour garçons à Tokyo. Sa femme a commencé des cours pour filles, ce qui a été l'un des premiers pas jamais réalisés vers l'éducation des femmes japonaises. En 1867, le dictionnaire actuel a été publié, une œuvre pionnière dans le domaine, et en 1891, il a publié un dictionnaire biblique, dont les bénéfices ont été utilisés pour l'église Shiloh à Yokohama et le Meiji Gakuin.
Il a également joué un rôle actif dans la traduction de la Bible en japonais, étant responsable d'environ trois quarts de la traduction. En 1859, avec l'ouverture du Japon aux Américains, lui et sa femme ont navigué sous la commission du Conseil presbytérien pour Kanagawa. Le 18 octobre 1859, ils étaient parmi les premiers missionnaires américains au Japon.Il était l'un des fondateurs et le premier président de Meiji Gakuin, une école pour garçons à Tokyo. Sa femme a commencé des cours pour filles, ce qui a été l'un des premiers pas jamais réalisés vers l'éducation des femmes japonaises. En 1867, le dictionnaire actuel a été publié, une œuvre pionnière dans le domaine, et en 1891, il a publié un dictionnaire biblique, dont les bénéfices ont été utilisés pour l'église Shiloh à Yokohama et le Meiji Gakuin.